土壌汚染調査・浄化 株式会社アイ・エス・ソリューション

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発表論文

クロロエテン類を対象とした原位置バイオレメディエーションにおけるDehalococcoides属細菌の挙動解析

(著作者)
  • 崎原盛1
  • 草場周作1
  • 養王田正文2
  • 西村実1
  • 1株式会社アイ・エス・ソリューション
  • 2東京農工大学

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1.はじめに

テトラクロロエチレン(PCE)やトリクロロエチレン(TCE)などクロロエテン類の生物浄化方法として、徐放性水素供給材を用いたバイオスティミュレーションが確立されている。本工法は、嫌気性細菌の脱ハロゲン呼吸を利用したものであり、PCE の塩素が段階的に水素に置換されてTCE、ジクロロエチレン(DCE)異性体、塩化ビニル(VC)を経て最終的にエチレンに変換される。本工法の成否は、分解微生物の有無に依存し、微生物によっては中間物質であるcis-DCE を分解できず、そのために浄化サイトにcis-DCE の蓄積が見られる場合が多々ある。現在、cis-DCE を分解できるのは、Dehalococcoides 属細菌のみである。そこで、本工法を効率的かつ安全に進めるためには、Dehalococcoides 属細菌の存在や量、種類をモニタリングすることが重要である。

本稿では、クロロエチレン類複合汚染サイトにおいて、浄化前にDehalococcoides 属細菌の存在を確認し、浄化過程で同細菌の経時変化を調査し、浄化前・過程でのDehalococcoides 属細菌のモニタリングの必要性について検討した。

2.クロロエテン類を対象とした原位置バイオレメディエーション

2.1 クロロエテン類分解微生物

クロロエテン類の分解に関与する微生物は、好気性微生物と嫌気性微生物に大別される。各微生物の分解特性を表1に示す。土壌・地下水などは一般的に嫌気的条件下にあることから、多くは嫌気性微生物を利用したバイオスティミュレーションが選択されることが多い。

嫌気性細菌によるクロロエテン類分解過程を図1に示す。この分解過程では、多くの嫌気性細菌が、TCEの分解までで反応が停止してしまい、その結果cis-DCE が蓄積されてしまう。現在までに、cis-DCE をエチレンまで分解できる微生物は、Dehalococcoide 属細菌のみしかわかっていない。また、Dehalococcoide属細菌の中でも、Dehalococcoides sp. strain 195 を代表としたPCE やTCE を主要なエネルギー源とするタイプ(本稿ではDehalococcoide 属TCE 分解菌と定義。ただしこのタイプも分解速度は遅いもののcis-DCE は分解できる。)と、Dehalococcoides sp. strain BAV1 を代表とするcis- DCE やVC を主要なエネルギー源とするタイプ(本稿ではDehalococcoides 属DCE 分解菌と定義)に大別される。

2.2 原位置バイオスティミュレーションを適用する際の留意点

嫌気性バイオスティミュレーションの場合、汚染浄化サイトに生息する微生物の分解能を利用することから、適用サイトに目的の分解微生物が存在するか否かが重要となってくる。

上野ら(2002)の報告では、国内の14箇所のTCE 汚染サイトから土壌・地下水を採取し、Dehalococcoides 属細菌の検出を試みたところ、TCE を完全に分解できる7 箇所のサンプルからDehalococcoides 属細菌が検出されたが、cis-DCE で分解が停止した5 箇所と全く分解が進行しなかった2箇所のサンプルでは、Dehalococcoides 属細菌が検出されなかった。また、Hendrichson ら(2002)による北米・欧州を対象とした同様の調査(24 箇所で実施)でも、完全脱塩素化が観察された21 箇所ではDehalococcoides 属細菌が検出され、cis-DCE で分解が停止した3 箇所では検出されなかった。よって、原位置バイオスティミュレーションを適用しエチレンまでの完全浄化をする場合、Dehalococcoides 属細菌の存在が重要となる。また、Dehalococcoides 属細菌が存在するといって、必ずしも分解に関与するとは限らない。

そこで、本稿では実際の浄化サイトを用いて、浄化前・浄化中におけるクロロエテン濃度とDehalococcoides 属細菌のモニタリングを行い、モニタリングの必要性について検証した。

3.試験方法および結果

3.1 浄化前におけるDehalococcoides 属細菌の存在・種類の確認

適用サイトは深度GL-3.0m~7.0m にcis-DCE の蓄積があるクロロエテン類複合汚染が確認されたサイトである。原位置バイオスティミュレーション適用サイトとし、図2の3 地点とした。

はじめに、3地点(図2の地点1から地点3)の地下水の上流及び下流に観測井を設置し、地下水を採取し微生物DNA を抽出した。Dehalococcoides 属細菌由来16SrRNA 遺伝子をターゲットとしたPCR によりDehalococcoides 属細菌の存在を確認した。DNA ポリメラーゼはEx Taq(タカラバイオ)を使用し、反応は加熱後(94 ºC、2min)、変性(94 ºC、1min)、アニーリング(58 ºC、1min)、伸長(72 ºC、1.5min)を1サイクルとし、25 サイクル行った。PCR 反応溶液の組成は、タカラバイオの推奨する条件とした。

その後、Real Time PCR 法により、Dehalococcoides 属TCE 分解菌及びDehalococcoide 属DCE 分解菌について定量した。Dehalococcoides 属TCE 分解菌はtceA 遺伝子、Dehalococcoides 属DCE 分解菌はbvcA 遺伝子をターゲットとした。

TaqMan Master mix(Applied Biosystems)を使用し、反応は加熱(50ºC、2min)、変性後(95 ºC、10sec)、加熱(95 ºC、15sec)と伸長(60 ºC、1min)を1 サイクルとし、40 サイクル行った。Real Time PCR 反応溶液の組成はApplied Biosystems が推奨する条件とした。

PCR の結果、地点1および地点2では、Dehalococcoides 属細菌の存在は確認できた。しかし、地点3ではDehalococcoides 属細菌は検出されなかった。Real Time PCR の結果を、表2 に示す。

表2より、地点1および地点2では、存在量の違いはあるもののDehalococcoide 属TCE 分解菌およびDCE 分解菌の存在が確認された。地点3 においては、いずれも検出されなかった。地点3で検出されなかった理由としては、当地点の地下水が高アルカリ性(pH9~11)のため、生育が困難な土壌・地下水環境が形成されたためと考えられる。

3.2 原位置バイオスティミュレーション適用サイトの選定

3.1 にてDehalococcoides 属細菌の存在が確認された地点1、地点2で、徐放性水素供給剤を用いた原位置バイオスティミュレーションを開始した。地点1では薬剤A を、地点2では薬剤B を用いた。

Dehalococcoides 属細菌が確認されなかった地点3は、浄化の効果が期待できないことから、適用サイトから除外した。

注入範囲は各エリアともに1.5m×1.5mとし、注入深度はGL-2.0,3.0 ,4.0 ,5.0 ,6.0 ,7.0mの6 深度とした。

3.3 浄化中におけるDehalococcoides 属クロロエテン類分解細菌のモニタリング

薬剤を注入前、注入30 日後、60 日後におけるクロロエテン類の濃度とD halococcoides 属クロロエテン類分解菌数の推移をReal Time PCR 法にて測定した。反応条件および反応溶液の組成は、3-1 に準じた。結果を図3に示す。

図3の結果から、各薬剤注入後、全地点において、クロロエテン類の脱塩素化に伴ってDehalococcoide属TCE 分解菌およびDCE 分解菌の増殖が確認された。これより、薬剤の効果的注入により、微生物の増殖を促進することができた。また、PCE およびTCE の汚染が見られないエリア(A1、A2、B2)では、cis -DCE およびVC の脱塩素化に伴って、Dehalococcoides 属DCE 分解菌の増殖が顕著であるのに対し、PCE およびTCE の複合汚染が見られるB1 地点では、Dehalococcoides 属TCE 分解菌の増殖が顕著であった。よって、今回の適用サイトでは、汚染物質の濃度に応じて分解微生物の挙動が変化し、効果的にクロロエテン類を分解していることが分かった。

4.まとめ

3の結果より、Dehalococcoides 属細菌の有無を浄化前に確認することで、浄化サイトの浄化能力の把握することができた。浄化中のモニタリングを行うことで、メインで働く分解菌を把握することでき、効率よく原位置バイオスティミュレーションを管理することが出来た。

今後は、ナチュラル・アテニュエーションの際の浄化の計画・管理などに活用していきたいと考えている。

【参考文献】

1)

上野俊洋、他:土壌汚染とその防止対策に関する研究集会, 第8回講演集、361(2002)

2)

E.R.Hendrickson, et al, Appl.Envioron.Microbiol.,68(2),485(2002)

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